1845. november 30-án sebészdoktorrá avatták. 1847-es itáliai szakmai utazása után fájdalommal értesült barátja, kollégája haláláról; Jacob Kolletschka boncolás okozta vérmérgezésben hunyt el. Eltöprengett ezen és még az év márciusában felismerte, hogy az a betegség, amely barátja halálát okozta és az, amelyet gyermekágyi láz néven ismertek, azonosak. Már Bécsben, majd 1851-től a pesti Szent Rókus Kórház szülészeti osztályának főorvosaként kimutatta az aszeptikus (fertőzést megelőző) eljárások előnyeit a szülészetben és a sebészetben. Mind gyakorlatával, mind írásaiban próbálta terjeszteni nézeteit, de sajnos az orvostársadalom nem vett róla tudomást. Az antiszeptikus eljárások jelentőségét és annak bevezetését is csak Joseph Lister angol sebész meggyőző munkája (1877) nyomán, lassanként fogadta el az orvosszakma. Semmelweis első megállapítása az volt, hogy a klórvizes kézmosás megszünteti a kézen a boncolás utáni hullaszagot. A későbbi összefüggésre ennek alkalmazása közben jött rá. Ekkoriban a kórokozó baktériumokat még nem ismerték, ám ez nem akadályozta meg a klórt abban, hogy a kézre tapadt baktériumokat is megölje. Szinte ismeretlen magyar szülészként csak szélmalomharcot tudott folytatni a kor tekintélyes, és különböző elméleteket hirdető szülészeivel szemben. A mikroorganizmusok felfedezése, Louis Pasteur munkássága hozta meg az áttörést, ennek nyomán kezdett Lister is 1865-ben (Semmelweis halálának évében) a karbolsavas antiszepszissel foglalkozni.
Kötelezte az orvosokat, az orvostanhallgatókat és az ápolószemélyzetet a szülészeti osztályokra történő belépés előtti klórmész-oldatos kézmosásra, majd októberben kötelezővé tette az egyes betegek vizsgálata közötti klóros kézmosást is (ami könyékig, körömkefével végrehajtott, negyedórás procedúra volt). Akkoriban ezek rendkívül népszerűtlen intézkedések voltak, a statisztikai bizonyítékokat pedig egyszerűen komolytalannak tartották. Így kezdődött szélmalomharca az akkori hivatalos, tudományos világgal. Ragaszkodott a kórtermek rendszeres takarításához, szellőztetéséhez, napoztatásához és a gyakori ágyhuzatcseréhez. A takarékosságból szennyes ágynemű felhúzását elbocsátással büntette.
1865 júliusa közepétől kollégái szerint magatartásában az elmezavar jelei mutatkoztak; július 31-én Bécsbe vitték, és Balassa doktor beutalta a döblingi elmegyógyintézetbe. Agresszív magaviselete miatt ápolói súlyosan bántalmazták, valószínűleg ennek következtében két hét után meghalt. Életében nem kapta meg az őt megillető elismerést, a Magyar Tudományos Akadémia sem vette föl tagjai sorába. Az utókor azonban többféle módon adózik nagyságának: 1906-ban Strobl Alajos Semmelweis-szobrát előbb az Erzsébet téren, majd 1948-ban a később (1952-ben) róla elnevezett egykori munkahelye, a Szent Rókus Kórház előtt fölállították. 1969. november 7-én a Budapesti Orvosi Egyetem vette fel a nevét.
Az UNESCO 2013-ban felvette az „anyák megmentőjének” a gyermekágyi lázzal kapcsolatos felfedezését és annak 1847 és 1861 között keletkezett primer dokumentumait A világ emlékezete program kitüntetettjeinek 1992-től bővülő listájára.
Chicagóban, a Nemzetközi Sebésztársaság Halhatatlanok Csarnokában a világ legjelentősebb 12 orvosának szobra között szerepel az övé.